Жидкостная хроматография

ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, метод разделения, идентификации, количественного определения и физико-химического исследования веществ; вид хроматографии, в которой в качестве подвижной фазы (элюента) используется жидкость.

Историческая справка. Хроматография открыта М. С. Цветом в 1903 году в виде колоночного жидкостно-адсорбционного метода. Более полувека практическое применение метода было ограничено препаративным выделением веществ в чистом виде ионообменными процессами разделения редкоземельных и трансурановых элементов. Для аналитических целей метод не использовался в связи с длительностью (до нескольких часов) эксперимента, которая была обусловлена несколькими факторами (применением адсорбентов с размером зёрен более 50- 100 мкм, прохождением элюента через колонку под действием только силы тяжести, отсутствием проточных детекторов). Экспрессная аналитическая жидкостная хроматография создана в 1960-70-х годах, причём ускорение массообмена между подвижной и неподвижной фазами - увеличение скорости разделения - было достигнуто за счёт уменьшения диаметра зёрен адсорбентов. Использование мелких (5-10 мкм) зёрен потребовало, из-за возникшего большого входного давления, применения насосов высокого давления и привело к разработке жидкостной хроматографии высокого давления. Эффективность колонок при переходе к мелким фракциям адсорбента существенно возросла (в расчёте на единицу длины в несколько сотен раз превысила эффективность колонок в газовой хроматографии), поэтому современную экспрессную аналитическую жидкостную хроматографию с использованием жёстких адсорбентов мелкого зернения, насосов высокого (свыше 20 МПа) давления и проточных детекторов называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). По временам разделения ВЭЖХ не уступает газовой хроматографии, по областям применения значительно её превосходит.

Основные методы. Предложено несколько десятков методов и вариантов жидкостной хроматографии, которые позволяют разделять смеси соединений с молекулярными массами от 50 до нескольких миллионов, включая изомеры (в том числе оптические), макромолекулы синтетических и биополимеров, ионы, стабильные радикалы, вирусы и другие микрочастицы.

По механизму разделения выделяют следующие основные методы жидкостной хроматографии: адсорбционный - разделение происходит за счёт различной адсорбируемости компонентов смеси на поверхности твёрдого тела (адсорбента); распределительный - разделение за счёт различной растворимости в плёнке жидкой фазы, нанесённой на поверхность твёрдого носителя; ионообменный (ионный, ион-парный) - за счёт различной способности разделяемых ионов в растворе к ионному обмену с ионитом - неподвижной фазой (смотри в статье Ионообменная хроматография); эксклюзионный (молекулярно-ситовый, гель-фильтрационный, гель-проникающий) - разделение макромолекул полимеров, а также малых молекул и ионов за счёт различных размеров или формы и способности проникать в поры неионогенного геля - неподвижной фазы (смотри в статье Эксклюзионная хроматография); аффинный (биоспецифический) - разделение биологически активных соединений за счёт биоспецифических взаимодействий с комплементарными сорбционными центрами неподвижной фазы (смотри в статье Аффинная хроматография); лигандообменный - разделение за счёт различной способности разделяемых соединений к комплексообразованию с катионами металлов или функциональными группами неподвижной фазы; хиральный (энантиоселективный) - разделение энантиомеров за счёт взаимодействия с хиральными группами неподвижной или подвижной фазы, а также ряд других методов. К современным методам относятся противоточная, мембранная, высокотемпературная, циркуляционная, многомерная и другие варианты жидкостной хроматографии.

Основные параметры. Измеряемые величины, характеризующие жидкостную хроматографию, следующие: параметры удерживания (время удерживания t_R, объём удерживания V_R и фактор удерживания), эффективность колонки (число теоретических тарелок N или высота, эквивалентная одной теоретической тарелке, Н), селективность разделения (коэффициент селективности α - отношение времени удерживания двух соседних пиков на хроматограмме), степень разделения (отношение разности удерживания двух соседних пиков к сумме полуширин этих пиков, R).

На разделение влияет температура, расход и природа подвижной фазы. В зависимости от природы подвижной фазы меняется её элюирующая способность. В жидкостной хроматографии применяют изократический режим элюирования (подвижной фазой с постоянной элюирующей способностью) и градиентный (подвижной фазой с увеличивающейся во времени элюирующей способностью).

Селективность разделения связана с природой межмолекулярных взаимодействий сорбат - сорбент, сорбат - элюент, элюент - сорбент. В современных вариантах жидкостная хроматография учитывается влияние на характер этих взаимодействий геометрической структуры (например, при использовании сорбентов на основе циклодекстринов, жидких кристаллов, краун-эфиров), биологической и химической активности молекул, а также возможность разделения (в частности, полимеров) в критических условиях; осуществляется компьютерная оптимизация.

Проведение процесса. Жидкостные хроматографы состоят из ёмкости для элюента, насоса высокого давления (10-40 МПа), крана-дозатора, защитной и аналитической колонок, детектора, электронного блока детектора (блока питания, усилителя, аналого-цифрового преобразователя), термостатов колонки и ячейки детектора; для обработки информации используются компьютеры.

В ВЭЖХ применяется более 20 типов детектирующих систем; самые распространённые - спектрофотометрические, в том числе программируемые, с диодной матрицей (диапазон длин волн 200-900 нм), флуоресцентные, электрохимические, масс-спектрометрические, рефрактометрические, по светорассеянию. В медицине, биологии, фармацевтике (при расшифровке действующих начал экстрактов лекарственных растений) и в других областях широко используются гибридные методы, сочетающие жидкостную хроматографию и массспектрометрию (с системой ввода пробы в спектрометр методом электрораспыления - электроспрей), ЯМР- или ИК-спектроскопию. Пределы обнаружения достигают 10^-15-10^-9г.

Для разделения компонентов используют аналитические насадочные (внутренний диаметр 2,0-4,6 мм), микронасадочные (диаметр 0,5-1,0 мм), капиллярные (диаметр менее 0,05 мм; сорбционный слой иммобилизован на внутренних стенках капилляра), а также препаративные колонки (диаметр более 10 мм). Длина насадочных колонок 5, 10, 15, 25 см. Размер зёрен сорбента 1-10 мкм (чаще всего сферические частицы диаметром 5 мкм).

В зависимости от природы разделяемых соединений используют обращённо-фазовую хроматографию (ОФХ) или нормально-фазовую хроматографию (НФХ). В ОФХ сорбент (неподвижная фаза) менее полярен, чем подвижная фаза (элюент), в НФХ - более полярен. В первом случае удерживание возрастает с ростом гидрофобности молекул разделяемой смеси, во втором - с ростом полярности молекул. В ОФХ в качестве сорбентов используют силикагель с химически привитыми к поверхности алкильными цепями С₁-С₃₀ (чаще всего С₈ или С₁₈), в качестве элюентов - смеси метанол - вода, ацетонитрил - вода и др. с разным соотношением компонентов. В НФХ в качестве сорбентов применяют пористый силикагель, силикагель с привитыми нитрильными и аминогруппами. В ОФХ и в НФХ применяют также полимерные и углеродные сорбенты. Исходные пористые сорбенты обычно имеют удельную поверхность в пределах 100-400 м²/г, средний диаметр пор 8, 10, 20, 30 нм. При выборе сорбента оценивают эффективность, параметры удерживания, гидрофобность, стерическую селективность, способность образовывать водородные связи, ионообменную ёмкость и другие факторы.

Разработаны технологии получения новых сорбентов и колонок для ВЭЖХ, в частности сорбентов для перфузионной хроматографии, монолитных колонок, пористых полимеров с порами молекулярных размеров, макропористых углеродных сорбентов. В перфузионных колонках микропотоки элюента проходят через открытые макропоры сорбента, что приводит к уменьшению размывания хроматографических пиков по сравнению с обычными насадочными колонками. В монолитных колонках сплошной сорбционный слой создаётся непосредственно в колонке, например в виде жёсткого пористого полимерного блока.

Области применения. ВЭЖХ используется в биологии и биотехнологии (в том числе при расшифровке генома человека, решении задач протеомики, пептидомики, метаболомики), в медицине (например, для ранней диагностики заболеваний с использованием биохимических маркеров), в фармацевтике при создании новых лекарств и анализе их чистоты (в том числе энантиомерной), в судебно-медицинских экспертизах, в контроле окружающей среды и промышленных выбросов, технологических процессов и качества продукции в химической, нефтехимической, пищевой, микробиологической промышленности. Препаративную жидкостную хроматографию используют для выделения и очистки многих природных и синтетических веществ, в том числе биологически активных соединений, вирусов (гриппа, энцефалита и др.), белков и полипептидов; в промышленности - фуллеренов, инсулина, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмид ДНК, антибиотиков, оптических изомеров и др.

Лит.: Цвет М. С. О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу // Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Отд. биологии. 1903. Т. 14; Киселев А. В., Яшин Я. И. Адсорбционная газовая и жидкостная хроматография. М., 1979; Snyder L. R., Kirkland J .J. Introduction to modern liquid chromatography. 2nd ed. N. Y., 1979; Стыскин Е. Л., Ициксон Л. Б., Брауде Е. В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М., 1986; Беленький Б. Г., Ганкина Э. С., Мальцев В. Г. Капиллярная жидкостная хроматография. Л., 1987; Даванков В. А., Навратил Дж., Уолтон Х. Лигандообменная хроматография. М., 1989; Даванков В. А., Яшин Я. И. Сто лет хроматографии // Вестник РАН. 2003. Т. 73. № 7; Яшин Я. И., Яшин А. Я. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Состояние и перспективы // Российский химический журнал. 2003. Т. 47. № 1.